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CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）是一段成簇、規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列。其與CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）組成的CRISPR/Cas系統(tǒng)是廣泛存在于多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)主要通過(guò)適應(yīng)，表達(dá)和干擾三個(gè)階段來(lái)介導(dǎo)細(xì)菌的免疫過(guò)程（見圖1，圖片來(lái)自Barrangou, R. and Marraffini, L. Molecular Cell .2014.）。首先，在適應(yīng)階段，與病毒或質(zhì)粒序列同源的DNA短片段會(huì)被整合到CRISPR的間隔區(qū)；在表達(dá)階段，CRISPR基因序列的一級(jí)轉(zhuǎn)錄本pre-crRNA產(chǎn)生，并被加工成crRNA，crRNA與病毒或質(zhì)粒的靶序列匹配；在干擾階段，crRNA將Cas蛋白引導(dǎo)至與間隔區(qū)匹配的病毒或質(zhì)粒處形成效應(yīng)復(fù)合物，并利用Cas蛋白切割靶序列。其中，PAM序列是crRNA引導(dǎo)Cas蛋白正確識(shí)別靶序列的必要條件。

                               圖1

法國(guó)科學(xué)家Emmanuelle Charpentier在對(duì)化膿性鏈球菌的研究中發(fā)現(xiàn)了tracrRNA，并且2011年開始與Jennifer Doudna合作。Doudna是一位經(jīng)驗(yàn)豐富的生物化學(xué)家，對(duì)RNA有著豐富的知識(shí)。她們一起成功地在試管中再造了細(xì)菌的基因剪刀，并簡(jiǎn)化了剪刀的分子組成，使其更容易使用。兩個(gè)人因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)而獲得2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。其實(shí)還有一些生物學(xué)家對(duì)基因編輯技術(shù)做出了很多貢獻(xiàn)，例如華人科學(xué)家張鋒首次證明CRISPR基因編輯可用于真核生物中。

之后大家繼續(xù)思考，既然crRNA可以引導(dǎo)Cas蛋白特異性識(shí)別靶序列，那CRISPR技術(shù)是否也可以應(yīng)用于核酸檢測(cè)中？答案是肯定的。隨著對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)研究的不斷深入，Cas蛋白的特點(diǎn)及功能活性被逐漸認(rèn)識(shí)并應(yīng)用，并且發(fā)現(xiàn)了更多的Cas蛋白，Cas12a、Cas13a等被定義并命名。表1中列出用于分子診斷的CRISPR/Cas系統(tǒng)及其特點(diǎn)。其中可以看到，Cas12a主要靶向單鏈或雙鏈DNA，而Cas13a可以直接靶向RNA。

                               表1

2018年，Chen等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CRISPR/Cas12a蛋白以序列特異性的方式切割dsDNA時(shí)，會(huì)誘發(fā)強(qiáng)烈的、非特異性ssDNA 的反式切割。作者利用Cas12a 這一附屬切割活性開發(fā)了一種準(zhǔn)確快速的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法將Cas12a 與等溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合，命名為DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)，并實(shí)現(xiàn)患者樣品中人乳頭瘤病毒(HPV)高靈敏檢測(cè)。

從樣本中提取HPV的DNA，通過(guò)重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再將Cas12a-crRNA復(fù)合物和標(biāo)記有熒光淬滅的單鏈DNA探針加入反應(yīng)體系。當(dāng)Cas12a-crRNA復(fù)合物特異性結(jié)合并切割HPV的DNA時(shí)，激活Cas12a的非特異反式切割，即對(duì)單鏈DNA探針進(jìn)行切割，ssDNA熒光基團(tuán)在被切割后產(chǎn)生熒光信號(hào)并完成對(duì)樣本中HPV DNA的特異性檢測(cè)。DETECTR可以對(duì)樣本中HPV16和HPV18進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，相關(guān)原理示意圖見圖2。對(duì)25個(gè)樣本進(jìn)行DETECTR檢測(cè)結(jié)果與普通PCR檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果完全符合。

                      圖2

LwCas13a是第一個(gè)被用于核酸檢測(cè)中的Cas13a蛋白。Gootenberg等開發(fā)的基于Cas13a蛋白的檢測(cè)技術(shù)與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合，既可以檢測(cè)DNA靶標(biāo)，也可以檢測(cè)RNA靶標(biāo)。該技術(shù)被命名為SHERLOCK (Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)。檢測(cè)原理如圖3-a，由于Cas13a識(shí)別RNA靶標(biāo)，所以RPA擴(kuò)增后需要將產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA，后面的過(guò)程與DETECTR相似，Cas13a-crRNA特異結(jié)合RNA靶標(biāo)后，Cas13a的非特異性反式切割活性被激活，對(duì)周圍的熒光探針進(jìn)行切割從而發(fā)出熒光進(jìn)行檢測(cè)。

2018年Gootenberg等對(duì)SHERLOCK技術(shù)進(jìn)行升級(jí)，可以實(shí)現(xiàn)在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)3 個(gè)ssRNA 靶標(biāo)和1 個(gè)dsDNA靶標(biāo)。研究人員對(duì)17 種CRISPR/Cas13a 和/Cas13b 酶進(jìn)行了生化鑒定，選擇了3 種具有不同切割偏好的Cas13 蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b 和CcaCas13b)與Cas12a 和RPA結(jié)合使用，每一種擴(kuò)增的核酸靶標(biāo)與對(duì)應(yīng)的Cas-crRNA 相結(jié)合，可激活對(duì)應(yīng)Cas蛋白的活性而切割其對(duì)應(yīng)的特異性底物，從而產(chǎn)生多種不同的熒光響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同靶標(biāo)的檢測(cè)。相關(guān)原理見圖3-b。

                                    圖3

但是根據(jù)上面的應(yīng)用可以看出，CRISPR/Cas技術(shù)通常需要與等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)一起使用才能完成檢測(cè)，需要RPA對(duì)目標(biāo)靶標(biāo)擴(kuò)增后，CRISPR/Cas主要發(fā)揮的是特異性檢測(cè)的作用，是否可以不經(jīng)RPA等技術(shù)擴(kuò)增而直接利用CRISPR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測(cè)呢？很多學(xué)者也在這方面進(jìn)行了各種探索。

Hajian等在2019年開發(fā)一種CRISPR芯片，該芯片材質(zhì)基底為石墨烯，利用場(chǎng)效應(yīng)晶體管與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合來(lái)檢測(cè)是否有目標(biāo)序列的存在。石墨烯芯片上預(yù)制許多CRISPR/dCas9分子復(fù)合物。其中dRNP復(fù)合體可以解旋雙螺旋DNA，并且掃描整條DNA鏈，如果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列，dRNP復(fù)合體就可以調(diào)控場(chǎng)效應(yīng)晶體管來(lái)輸出電信號(hào)完成檢測(cè)。但是整個(gè)芯片的檢測(cè)成本較高。相關(guān)示意圖見圖4.

                                      圖4

2019年，Dai等通過(guò)探索Cas12a（cpf1）的反式剪切活性，想要開發(fā)一種通用的電化學(xué)傳感器。如圖5所示，Cas12a既有crRNA介導(dǎo)的特異性的順式剪切（cis-cleavage），也有非特異性的反式剪切活性（trans-cleavage）。圖5B中結(jié)合有亞甲基藍(lán)燃料的非特異的單鏈DNA報(bào)告分子被固定在金電極上。如果存在目標(biāo)分子，Cas12a-crRNA就會(huì)介導(dǎo)對(duì)非特異ssDNA報(bào)告分子的反式剪切，產(chǎn)生較低的電化學(xué)信號(hào)；而如果沒有目標(biāo)分子存在，Cas12a-crRNA不會(huì)激活其反式剪切活性，報(bào)告分子不會(huì)被切割，就會(huì)產(chǎn)生比較高的電化學(xué)信號(hào)，以此來(lái)判斷是否存在目標(biāo)序列。

                                                                              圖5

CRISPR技術(shù)在核酸檢測(cè)中優(yōu)點(diǎn)主要有：

1）對(duì)單堿基突變有很高的分辨率；

2）更高的特異性和靈敏度；

3）陸續(xù)發(fā)現(xiàn)新的更有價(jià)值的Cas蛋白，可以更特異以及準(zhǔn)確的進(jìn)行分子檢測(cè)。

但是同時(shí)也有相應(yīng)的局限性：

1）設(shè)計(jì)時(shí)在3’端需要合適的PAM序列，PAM序列使crRNA引導(dǎo)Cas蛋白正確識(shí)別靶序列的必要條件；

2）目前在多重檢測(cè)中還有許多限制；

3）目前大部分都是與RPA等擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合使用，但是擴(kuò)增也可能會(huì)引入誤差，同時(shí)也有污染的風(fēng)險(xiǎn)。

CRISPR/Cas技術(shù)在核酸檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用，為核酸檢測(cè)提供了新的思路。未來(lái)的研發(fā)方向主要是更加流程化，減少中間的操作步驟，使得檢測(cè)更加快速和便捷。隨著基于CRISPR/Cas技術(shù)的核酸檢測(cè)平臺(tái)的不斷發(fā)展，未來(lái)在分子診斷方面將發(fā)揮更重要的作用。

參考文獻(xiàn)

1.周桓等，Acta Microbiologica Sinica，2021,61(12):3856-3869.

2.Chen, et al. Science. 2018; 360(6387):436-439.

3.Gootenberg, et al. Science. 2017;356(6336):438-442.

4.Gootenberg, et al. Science. 2018; 360: 439-444.

5.Liu, et al. Lab Chip, 2023, 23, 1467–1492.

6.Hajian, et al. Nat Biomed Eng. 2019; 3(6): 427-437.

7.Dai, et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2019; 58(48): 17399-17405.

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