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氨基比林-N-去甲基酶(AND)檢測試劑盒(分光光度法 50T/24S)

貨號 SH0603 售價(元) 936
規(guī)格 50T/24S CAS號
  • 產品簡介
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貨號

名稱

規(guī)格

SH0603

氨基比林-N-去甲基酶(AND)檢測試劑盒(分光光度法 50T/24S)

50管/24樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義:

細胞色素P450酶是一組在外源物質代謝中,尤其是藥物和毒物,具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員,相當于CYP3A4亞型,與藥物的去甲基化反應密切相關。

測定原理:

AND催化氨基比林釋放甲醛,通過Nash比色法測定甲醛含量,即可計算出AND活性。

組成:

產品名稱

SH0603-50T/24S

Storage

試劑一:粉劑

1

4℃

試劑二:液體

1

4℃

試劑三:粉劑

1

4℃避光

試劑:粉劑

1

4℃

試劑五:粉劑

1

室溫

試劑:液體

1

室溫

試劑:液體

1

4℃

標準液:液體

1

-20℃

說明書

一份

 

試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加50ml蒸餾水充分溶解。

試劑三:粉劑×1瓶(棕色瓶),4℃避光保存。臨用前加入2.6ml無水乙醇,充分溶解。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2.6ml蒸餾水,充分溶解。

試劑五:粉劑×1瓶,室溫保存。臨用前加蒸餾水10ml充分溶解。

標準液:液體×1瓶,-20℃保存。臨用前取1.5ml EP 管,加入10μl標準液,加990μl蒸餾水,混勻即為0.05 mmol/L標準甲醛溶液,4℃保存。

自備儀器和用品:

可見分光光度計、普通離心機,超速離心機、水浴鍋、可調式移液槍、1ml玻璃比色皿、蒸餾水、無水乙醇和冰。

粗酶液提取

1、除去細胞核,線粒體等大分子物質:稱約0.5g組織,加入1ml試劑一,冰上充分研磨,10000g 4℃離心30min,取上清液轉入超速離心管。

2、粗制微粒體:4℃,10000g,離心60min,棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質:向步驟2的沉淀中加1ml試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,10000g離心30min,棄上清液。

4、最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5ml,蓋緊后充分震蕩溶解,即粗酶液,待測。該待測液需當天使用。

AND活性測定操作:

1. 分光光度計預熱30 min,調節(jié)波長到412 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30min

3. 對照管:取1EP管,加入50μl粗酶液,850μl試劑二,50μl試劑三,50μl蒸餾水,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入175μl試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入175μl試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新的EP管,加入500μl上清液,500μl試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A對照管。

4. 測定管:取1EP管,加入50μl粗酶液,850μl試劑二,50μl試劑三,50μl試劑四,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入175μl試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入175μl試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取1支新EP管,加入500μl上清液,500μl試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A測定管。

5. 標準管:取1EP管,加入500μl標準品,500μl試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A標準管。

注意:每個樣品都需要做對照管。

AND活性計算:

(1).按照蛋白濃度計算:

活性單位定義:37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/mg prot)= C標準品×V標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷Cpr×V樣)÷T

= 45×A測定管-A空白管)÷A標準管÷Cpr

(2).按照樣本質量計算:

活性單位定義:37℃中每分鐘每克樣品催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/g 鮮重)= C標準品×V標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(W×V)÷T

= 45×A測定管-A對照管)÷A標準管÷W

C標準品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標準品:500μl=0.0005 L;稀釋倍數:V反總÷V上清液=50+850 +50+50+175+175÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質濃度mg/ml,需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;V樣:加入粗酶液體積,50μl=0.05mlW:樣本質量,g ;T:反應時間,30min

 

注意事項:

1、粗酶液需在當日完成測定,如需保存,則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油,分裝后,-80℃保存;

2、試劑三和試劑四需臨用前配制,如當天沒有用完,4℃避光保存,可用1周;

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測定,建議用BCA法測蛋白含量。

 

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